Tartalom
- szakaszában
- 1. módszer Azonosítsa a baktériumot grammos folttal
- 2. módszer Végezzük el a Ziehl-Neelsen festési tesztet
- 3. módszer Tanulja meg a baktériumok viselkedését és megjelenését
- 4. módszer Értelmezze az összes eredményt
A baktériumok azonosítása összetett feladat. Ennek egyik oka az, hogy becslések szerint 10 000 és 1 milliárd baktériumfaj található a világon! A baktériumok megfelelő azonosítása nagyon fontos, különösen az orvosi területen, ahol a betegség megfelelő kezelése nagyban függ a problémát okozó mikrobától. A legtöbb esetben az azonosítást a kizárás alapján végzik. A baktérium azonosításához el kell végeznie a festési vizsgálatokat, elemeznie kell annak megjelenését és meg kell figyelnie, hogyan reagál jól a különböző körülményekre. Ha gyors eredményre van szüksége, vegyen DNS-mintát a laboratóriumba küldéshez.
szakaszában
1. módszer Azonosítsa a baktériumot grammos folttal
- Határozzuk ha a baktériumok gram-pozitívak vagy negatívak. A Gram-festés módszer a baktériumok megosztására a két leggyakoribb típus között: Gram-pozitív és Gram-negatív. Az előbbiek vastag sejtfallal rendelkeznek, amelyet peptidoglikánnak nevezett polimerből állnak, amely a Gram-negatív baktériumok vékony falával a legjobb festéssel rendelkezik.
- A gram-pozitív baktériumok néhány általános típusa a sztreptokokok, sztafilokokok, mikrokokok (vagy mikrokokok) és a listeria.
- Íme néhány általános példa a Gram-negatív baktériumokra: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium és Campylobacter.
- Tegyen megfelelő védőintézkedéseket. A teszt során felhasznált baktériumok és kémiai elemek veszélyt jelentenek az egészségre. A festési vizsgálat elvégzésekor viseljen védőszemüveget, eldobható nitril kesztyűt és laboratóriumi kabátot. Ha kész, helyezze a kesztyűt és az összes többi szennyezett anyagot egy speciális tasakba. Ne felejtse el követni laboratóriumának eljárásait, hogy megszabaduljon a szennyezett termékek zsákjától.
- Helyezze a megfigyelhető mintát egy üveglemezre. A vizsgálat megkezdéséhez tegyen egy csepp vagy baktériummintát egy steril tárgylemezre. Ezután csúsztassa a pengét háromszor megvilágított Bunsen égő fölé, hogy rögzítse a mintát, és megakadályozza, hogy az kijönjen a lemezből, amikor öblítjük vagy hozzáadjuk a reagenseket.
- Adjunk hozzá 5 csepp lila kristályt a késhez. Öntsünk öt csepp kristály ibolya oldatot a mintára. Várjon egy percet, amíg a minta felszívja a kristályibolya.
- Tartsa a pengét a ruhacsapokkal a helyén, hogy ne foltosítsa a kezét.
- Alaposan mossa le a pengét a folt eltávolításához. Használjon csapot vagy palackot, és hagyja, hogy a víz nagyon lassan folyjon legfeljebb öt másodpercig, hogy eltávolítsa a tintamaradékokat, amelyek nem tapadtak a mintához.
- Öntsön öt csepp grammdiódás foltot a diára. Ez egy diódából, nátrium-hidrogén-karbonátból és kálium-diodidból álló oldat, amely a kristályibolya megolvad a baktériumok sejtfalával. Öntsön öt csepp oldatot a mintára, és hagyja állni egy percig.
- Mossa le a mintát alkohollal vagy tejsavval. Az alkohol és a laceton fehérítő szerek, és kiküszöbölik a bakteriális sejtfalak elszíneződését, ha ezek gram-negatívak. Öntsen néhány csepp fehérítőt a mintára, és hagyja, hogy legfeljebb három másodpercig működjön. Ezután próbálja meg öt másodpercig óvatosan öblíteni vízzel, hogy eltávolítsa ezeket a fehérítőszereket.
- Ha hagyja, hogy a fehérítő hosszú ideig működjön, az eredményezheti a gram-pozitív baktériumok elszíneződésének eltűnését, ami hamis negatívvá válhat.
- Végezzen egy kontrasztvizsgálatot szafraninnal. A szafranin egy vörös festék, amely ellentétben áll a kristályibolykával, így a lila festés által nem befolyásolt baktériumokat színezi. Öntsön körülbelül öt csepp szafranint a mintára, és hagyja bekapcsolni egy percig. Ezután próbáljon öt másodpercig óvatosan öblíteni vízzel.
- Képzelje el a mintát 1000-szeres nagyítással. A baktériumok lila vagy lila lesz, ha grampozitív, vagy rózsaszín, ha gramm negatív a szafranin miatt.
2. módszer Végezzük el a Ziehl-Neelsen festési tesztet
- Ezt a technikát használhatja sav-gyors baktériumok kimutatására. Ezek a fajok nagyobb mennyiségű lipideket tartalmaznak, ellenállóbbé téve őket a Gram-festés során alkalmazott színezékekkel szemben. A sav-rezisztens baktériumok a Mycobacterium nemhez tartoznak, ide tartozik a tuberkulózisért felelős baktérium (M. tuberculosis). Savas rezisztens baktériumok festéséhez vörös festéket kell használni, úgynevezett karbolos fuksinnak, amely ellenáll a savas vagy kénsav oldatokkal való öblítésnek.
- Tegyen megfelelő védőintézkedéseket. A Ziehl-Neelsen festés során használt kémiai és biológiai anyagok veszélyesek lehetnek. Ezenkívül hőforrásokat is kell használnia, például Bunsen fúvókát, elektromos fűtőkészüléket vagy alkoholos lámpát. A teszt végrehajtásához kövesse az alábbi utasításokat.
- Helyezzen védőszemüveget, nitril kesztyűt és laboratóriumi kabátot.
- Vigyázzon, ne lélegezzen be festékeket és fehérítőket, és ne engedje, hogy a cseppek fröccsenjenek a szemére vagy a bőrére. Tartsa nyitva a tartályokat a motorháztető alatt.
- Légy nagyon óvatos a penge melegítésekor. A használt vegyszerek többsége tűzveszélyes. A dián vagy más berendezésen gyúlékony anyagok nyomai is lehetnek.
- Készítse elő a pengét. Körkörös mozdulatokkal egyenletesen terítsen el egy kis mennyiségű baktériummintát egy steril tárgy közepén. A mintának kb. 10 mm és 20 mm közötti helyet kell foglalnia.
- Szárítsa meg a pengét. Helyezze a pengét a szárítószerkezetre úgy, hogy a minta felfelé nézzen. Hagyja természetesen megszáradni 30 másodpercig. Ne próbálja meg kendővel szárítani a pengét.
- Rögzítse a mintát hővel. A mintát felfelé csúsztassa kétszer vagy háromszor a pengét egy megvilágított Bunsen égőre. A pengét elektromos fűtőkészülékre is helyezheti úgy, hogy a hőmérsékletet legalább két órán keresztül 65 ° C és 75 ° C között beállítja. Vigyázzon, ne forralja vagy égesse el a mintát.
- Adja hozzá a karbolos fuksint a pengéhez. Öntsön több csepp oldatot a tárgylemezre. Öntsön eleget ahhoz, hogy teljesen lefedje a mintát.
- Melegítse a pengét a festék rögzítéséhez. Óvatosan melegítse a lemezt egy Bunsen égővel vagy alkoholos lámpával, a mintát felfelé irányítva, vagy helyezze elektromos fűtőberendezésre. Melegítsük a pengét 60 ° C-ra, vagy amíg el nem kezd gőzkibocsátás. Hagyja a festéket hat percig hatni.
- Elektromos fűtőberendezés használata esetén kapcsolja be 60 ° C-on. Ha az alkohollámpát vagy a Bunsen égőt választja, akkor számíthat füstre.
- Ahhoz, hogy a pengét 5 percig a kívánt hőmérsékleten tartsa, szakaszosan melegítse.
- Vigyázzon, ne forralja, égesse el és szárítsa meg a mintát.
- Öblítse le a pengét hideg vízzel. Hagyja lehűlni öt percig, majd néhány másodpercig óvatosan öblítse le tiszta vízzel. Használjon csapvizet vagy egy palackot a festékfoltok eltávolításához, amelyek nem tapadtak a mintához.
- Öntsük a mintára savas alkoholt vagy kénsavat. Használjon 3 térfogatszázalék alkoholt vagy 20 térfogat% kénsavat a minta teljes lefedéséhez. Hagyja, hogy a sav működjön, amíg a szín elhalványul, és nem ér el egy nagyon világos rózsaszín árnyalatot. A folyamat általában körülbelül tíz percig tart.
- Használjon tiszta vizet a penge öblítéséhez. Óvatosan mossa le a pengét egy csap alatt vagy egy préselhető palack segítségével. Távolítsa el az összes sav- és festékmaradványt jól.
- Adja hozzá a kontrasztanyagot. Miután öltötte a tárgylemezt, öntsön rá malachitzöld vagy metilénkék festéket. Ez a két oldat kékes vagy zöldes hátteret hoz létre, amelyen a vörös festék felbukkan, valamint más biológiai anyagokat, például emberi sejteket és nem saválló baktériumokat. Hagyja, hogy az anyagok egy-két percig működjenek.
- Öblítse le és szárítsa meg a pengét. Alaposan öblítse le vízzel a felesleges kontraszt eltávolításához. Ha kész, szárítsa meg a penge hátulját egy száraz ruhával, és hagyja természetesen megszáradni egy állványon.
- Képzelje el a mintát 1000-szeres nagyítással. A saválló baktériumok vörösre vagy sötét rózsaszínre válnak. Más baktériumok, nem baktériumsejtek és a penge alapja zöld vagy kék színűvé válik.
3. módszer Tanulja meg a baktériumok viselkedését és megjelenését
- Elemezze a baktériumok alakját. A festési vizsgálat elvégzése után annak meghatározása érdekében, hogy a baktériumok gram-pozitív, gram-negatív vagy sav-rezisztens -, ideje pontosabban azonosítani a fajokat. Először elemezze a lemezen lévő baktériumok alakját. A három leggyakoribb forma a cocci (gömb alakú), spirál és a bacillus (rúd alakú).
- Ezeknek a formáknak több változata létezik. Kerek alakú baktériumok (coccus) például párokban (diplococcusok), láncokban, halomban vagy négyes csoportokban (tetradák) jelenhetnek meg.
- Tudja meg, hogy a baktériumok aerob vagy anaerob baktériumok. Vegyen két baktériummintát, és hozzon létre két külön tenyésztést. A holdnak anaerobnak (oxigén nélkül termesztettnek), míg a másiknak aerobnak (oxigénnel termesztettnek) kell lennie. Az anaerob tenyészetet 35 ° C-on, oxigénmentes helyen tárolja legalább 48 órán keresztül, mielőtt megnézné a növekedést.
- Ha a baktériumok oxigén nélküli környezetben nőnek, de nem érintkeznek oxigénnel, ez azt jelenti, hogy anaerobok.
- Annak ellenére, hogy oxigénnel kezelt környezetben fejlődnek ki, de nem oxigén hiányában, aerobak.
- Amikor mindkét környezetben fejlődnek, akkor fakultatív anaerob baktériumokról beszélünk.
- Végezzen egy motilitási tesztet. A baktérium akkor mozgatható, ha képes egyedül mozgatni egy vagy több flagella-val. Bizonyos baktériumfajok azonosításában a motilitás foka nagyon fontos. A mozgékonyság többféle típusa létezik, de a legbiztonságosabb és legjobban olvasható módszer a félig szilárd közeg.
- Készítsen kultúrát a motilitási teszthez. Készítsen elő baktériumtenyészetet egy tápközegben. Kövesse az alábbi utasításokat a választott húsleves készítéséhez.
- Inokuláljuk a tenyészetet egy félszilárd agar agarban a motilitási vizsgálatokhoz. A levestenyészet egy részét bevonjuk egy steril oltó tűvel. Óvatosan ültesse a tűt a félig szilárd dagar csőbe, például a TTC lagarba, amelyet a teszthez előkészített. A tűnek be kell hatolnia az agar 2/3-át.
- Ha kész, óvatosan távolítsa el a tűt, ügyelve arra, hogy ne lépje túl a beoltási zóna határait.
- Inkubáljuk a csövet 30 ° C-on 48 órán keresztül.
- Olvassa el a teszt eredményét. A motilitási teszt agarja pirossá válik a baktériumokkal való érintkezéskor. Ha mobilok, ez a vörös vagy rózsaszín árnyalat elterjed az egész anyagban. Ellenkező esetben a festés az injekció beadásának helyére korlátozódik.
4. módszer Értelmezze az összes eredményt
- Gyűjtse össze észrevételeit. Ahhoz, hogy megismerje a baktériumok fajtáját, össze kell gyűjtenie a kultúrákból nyert információkat, a színező teszteket és a formák megfigyelését. Ha a beteg mintáit vizsgálja, az általuk jelentett tünetek szintén segíthetnek a megfelelő baktériumtípus meghatározásában.
- Például, ha a tesztek azt mutatják, hogy a baktériumok gram-negatív, anaerob, nem motívumok, és olyan tüneteket észlel, mint hasi fájdalom, émelygés és hányás a betegben, akkor valószínű, hogy a beteg Bacteroides fertőzést szenved. fragilis.
- Keressen egy adatbázist. A világon ezer baktériumfaj van. Lehetetlen mindent szívből megismerni. Valószínűleg konzultálnia kell egy klinikai mikrobiológiai könyvvel vagy online adatbázissal a teszt eredményeinek összehasonlításához a baktériumfajokra vonatkozó információkkal.
- Kiváló online források állnak rendelkezésre a baktériumok azonosítására, de ezeknek az adatbázisoknak a többsége angol nyelven érhető el, köztük a Patricbrc.org és a GlobalRPh. Az INRA Nemzetközi Mikrobiológiai Erőforrás Központ webhelyén azonban továbbra is hasznos információkat találhat.
- Végezzen genetikai tesztet, hogy megismerje a baktériumok pontos faját. Bizonyos esetekben meg kell határoznia a baktériumfajokat. A leggyorsabb és legegyszerűbb módszer egy DNS-teszt elvégzése. A DNS-tesztek szintén hasznosak a hagyományos festési formákkal és tenyésztéssel szemben rezisztens baktériumok azonosításában. Manapság a mikroorganizmusokkal végzett DNS-tesztek nagyon gyorsak, és kevesebb, mint két órán belül készen állnak.
- Ha nincs hozzáférése olyan laboratóriumhoz, amely mikroorganizmusok genetikai szekvenálását végzi, küldjön baktériummintát egy speciális ügynökséghez.